Les conditions de culture sont les milieux de culture, la présence
ou non d’oxygène et la température d’incubation des bactéries.
Milieux
de culture
La majorité des bactéries croissent in vitro sur milieux de culture
(milieux gélosés et bouillons) : milieux ordinaires (type gélose
trypticase-soja), milieux enrichis (sérum, sang, ascite…), milieux sélectifs
(contenant des antiseptiques), milieux liquides d'enrichissement (contenant des
antiseptiques ou incubés à une température non permissive pour la flore
commensale mais laissant croître certaines bactéries pathogènes).
Aérobiose
et température
Les
bactéries sont incubées en aérobie ou anaérobie, ou en présence de C02
( 5-10%), définissant des bactéries aérobies, anaérobies ou microaérophiles
(10% O2 ). La température d’incubation est habituellement de
35-37°C.
vitesse
de croissance
(1)
La vitesse de croissance peut être rapide en 24-48h, (20 min à 60 min de temps
de génération pour la plupart des bactéries médicales courantes, telles que
staphylocoques, streptocoques, entérobactéries…).
(2)
Certaines bactéries ont une croissance lente : Mycobacterium tuberculosis (tuberculose)
croît en 2-3 semaines (temps de génération 24-48 h).
(3)
Certaines bactéries ne peuvent être cultivées in vitro (Mycobacterium
leprae, Treponema pallidum) et ont un temps de génération très long in vivo
chez l’animal de 12-14 jours.
(4)
Certaines bactéries nécessitent des milieux de culture particuliers leur
fournissant les nutriments et les conditions (osmolarité…) nécessaires à leur
croissance ( Mycoplasma, Borrelia, Leptospira).
(5)
Certaines bactéries sont des parasites intracellulaires stricts, comme les
virus, et requiert des milieux de culture cellulaire (Chlamydia, Rickettsia,
Trophe-ryma whippelii).
Les
colonies
Pour
la plupart des bactéries médicales courantes(staphylocoques, streptocoques,
entérobactéries…), des colonies visible à l’œil nu apparaissent sur la gélose
habituellement en 24-48 h. Chaque colonie correspond à environ 1-2 x 109 bactéries
et résulte de la multiplication rapide d’une seule bactérie (‘’clonage").
On note l’aspect des colonies, leur taille (1-3 mm), leur éventuelle
pigmentation (vert, jaune, rouge…), la présence d’une hémolyse sur gélose au
sang. La suite du processus d’identification part de colonies isolées pour
définir les caractères biochimiques d’identification.
Colonies de E coli en formation au bout de 4h. Descendance d’une
seule bactérie.
Colonies de H influenzae (gélose sang)
Identification
de l’espèce bactérienne
On identifie la bactérie suspecte dans des produits pathologiques
sur des caractères morphologiques, nutrition-nelles, respiratoires et
biochimiques.
Les
caractères morphologiques des bactéries et de leurs colonies :
(1)
coque, bacille, bactérie spiralée
(2)
bactérie à Gram positif ou négatif, ou non colorable par la coloration de Gram
( Ziehl-Neelsen : mycobactéries…).
-
Les exigences nutritionnelles : bactérie nécessitant des milieux enrichis
(hémine, ascite, sérum, sang ...) et requérant ou non des facteurs de
croissance : bactéries auxotrophes (facteurs de croissance : aminoacides,
vitamines…) ou prototrophes (croissan-ce sans facteur de croissance).
-
Les propriétés de respiration et de fermentation : bactérie aérobie, anaérobie
ou aéro-anaérobie, capable de respiration et/ou de fermentation des sucres,
utilisation des sucres (fermentation avec ou sans gaz) détectée par les
galeries dites API.
- La
production d’enzymes (catalase, oxydase, nitrate-réductase, protéases,
lécithinases,...)
L’ensemble
de ces caractères biochimiques définit le phénotype de la bactérie ou biotype.
Galeries
API
Exemples :
Isolement et identification de S
aureus
Isolement et identification de V
cholerae
Identification
de la souche
Dans un but épidémiologique, on est amené à préciser l’identité de
la souche en cause:
- la
constitution antigénique du pathogène : d’après les antigènes du
lipopolysaccharide (LPS) pour les bactéries à Gram - , des polyosides
capsulaires, des protéines d'enveloppe externe , permettant ainsi le sérotypage
par agglutination avec des sérums spécifiques.
- la
sensibilité à une batterie de phages permet aussi de définir des lysotypes (lysotypie).
-
Les techniques de biologie moléculaire donnent de nouveaux outils
épidémiologiques permettant de définir avec la précision des ‘’empreintes
digitales’’ la singularité d’une souche bactérienne. Les techniques les plus
utilisées sont électrophorèse en champ pulsé (PFGE), ribotypage et random PCR.
Ces techniques sont très utilisées pour détecter des épidémies
Antibiogramme
L’antibiogramme définit in vitro la sensibilité des bactéries
pathogènes. On utilise largement la méthode des disques, qui permet de voir le
diamètre d’inhibition de croissance autour des disques imprégnés d’antibiotiques.
Cette méthode standardisée donne de bons résultats en pratique. Elle peut être
complétée par des méthodes plus sophistiquées telles que la détermination des
concentrations minimales inhibitrices (CMI) et des concentrations minimales
bactéricides. On définit ainsi un phénotype de résistance naturel ou acquis.
Antibiogramme par la méthode des disques
L’ensemble de ces techniques classiques permet la plupart du temps
de résoudre les problèmes courants et de classer les bactéries sur des critères
objectifs et reproductibles, et de définir le genre et l’espèce de chaque
bactérie pathogène, ce qui guide l’antibiothérapie.
Apport
des méthodes moléculaires au diagnostic
Les méthodes de biologie moléculaire peuvent, dans des situations
cliniques limitées, améliorer le diagnostic bactériologique direct. Ces
méthodes sont basées sur la polymerase chain reaction (PCR) qui est
utilisée pour détecter des séquences bactériennes spécifiques de certaines
bactéries pathogènes. Les avantages principaux de la PCR sont d’augmenter
considérablement la sensibilité de détection des microorganismes et de pouvoir
déceler des microorganismes éventuellement non viables.
(1)
la PCR pour reconnaître des bactéries suspectées par la clinique :
La
PCR utilisant des primers spécifiques peut tenter de détecter
directement dans les produits pathologiques des fragments de génomes
bactériens. C’est un apport important pour le diagnostic des infections dues à
des bactéries à croissance lente, difficile ou impossible :
- Bordetella
pertussis, agent de la coqueluche, bacille Gram négatif à croissance
difficile
-
les bactéries à croissance intracellulaire stricts : Chlamydia trachomatis et
C pneumoniae responsable d’infections pulmonaires, oculaires et génitales,
Rickettsia spp (agent des typhus), Tropheryma whippeli, agent de
la maladie de Whipple
-
les mycobactéries de la tuberculose (Mycobacterium tuberculosis, M bovis)
et de la lèpre (Mycobacterium leprae)
-
les mycoplasmes : Mycoplasma pneumoniae, Ureaplasma urealyticum,
(responsables d’infections pulmonaires et génitales)
- Treponema
pallidum, agent de la syphilis La PCR pourrait aussi être utile pour les
infections où le diagnostic doit être rapidement établi (méningites), ou pour
détecter une résistance aux antibiotiques d’une bactérie à croissance lente,
telle que M. tuberculosis .
(2)
La PCR pour identifier une bactérie inconnue dans les tissus infectés et en
culture
L’amplification
de séquences de rDNA utilisant des primers universels ou de certains
gènes bactériens (gènes sod de la superoxyde-dismutase, rpoB de
la RNA polymérase …) avec des primers spécifiques, peut être utile dans
certains contextes cliniques difficiles, tels que les infections torpides des
immunodéprimés. Grâce aux banques de données, on peut identifier une bactérie
difficile à classer dans l’arbre phylogénétique.
Le
diagnostic indirect : détection des anticorps spécifiques
Le
sérodiagnostic est un appoint au diagnostic direct. Il est très utile dans
certains cas.
Les
meilleures indications sont :
(1)
le diagnostic d’une infection due à une bactérie à croissance difficile ou
impossible (Treponema pallidum, Chlamydia, Rickettsia, Leptospira, Borrelia...),
(2)
le diagnostic d’infections décapitées par les antibiotiques (antibiothérapie
précoce)
(3)
le diagnostic rétrospectif d’une infection récente
(4)
les études épidémiologiques cher-chant à déterminer l’impact d’un
micro-organisme sur une population.
Cinétique
de la production des anticorps
La
valeur du sérodiagnostic est fortement augmentée par la mise en évidence d’ une
cinétique de la production des anticorps. Les anticorps apparaissent en 7-10 j
en utilisant les techniques habituelles de détection (agglutination, ELISA…),
avec apparition d’IgM spécifiques. Le pic de production est entre 21 et 30 j,
les titres diminuant ensuite pour atteindre un taux résiduel (IgG) après 2-3
mois qui persistera des années.
Interprétation
du sérodiagnostic
On doit donc pratiquer deux tests sérologiques à 15 jours
d’intervalle : un sérum le plus précoce possible après le début clinique
(souvent négatif), un sérum tardif 15 jours plus tard. Si ce 2ème test
est positif, on parle de séroconversion (apparition d’anticorps spécifiques).
La mise en évidence d’une ascension des titres d’anticorps est aussi un bon signe
en faveur d’une infection en évolution (souvent une primo-infection).
Cependant, il faut garder à l’esprit la possibilité de réactions antigéniques
croisées fréquentes avec d’autres bactéries. Le sérodiagnostic est donc un diagnostic
de suspicion. Son interprétation attachera une bonne valeur à la détection
d’IgM, d’une séroconversion, ou d’une ascension des titres d’anticorps.
Classification très simplifiée des bactéries d’intérêt médical.
Le principe des principales méthodes d’épidémiologie moléculaire utilisées en bactériologie
